Identificação, Isolamento e Caracterização de Bactérias de Solo de Cerrado Pertencentes ao Filo Acidobactéria

Abstract

O solo do bioma Cerrado apresenta uma comunidade microbiana pouco estudada, mas estudos metagenômicos revelaram a presença de Acidobacteria em quatro de suas diferentes fitofisionomias. Embora sequências do gene do RNAr 16S destas bactérias sejam encontradas em amostras de todo o mundo, existem, ao todo, apenas 14 espécies descritas, sendo pouco conhecido sobre sua fisiologia e seu papel no ambiente. No presente trabalho, um meio utilizado para isolamento de Acidobacteria em solo australiano foi testado para cultivar acidobactérias de solo de Cerrado. O solo obtido de reserva do IBGE foi utilizado em experimentos preliminares e demonstrou que em meio VL55 com xilana, quando comparado ao meio R2A, o surgimento das colônias é lento e há uma maior variabilidade na morfologia das colônias. Além disso, mostrou também que a melhor diluição foi a de 10-6, assim como a necessidade de adição de ciclohexamida para inibir crescimento de fungos. Solos de três locais diferentes da Fazenda Capão Comprido foram utilizados para o isolamento de acidobactéria, e apenas o meio VL55 foi utilizado. Inicialmente foi utilizada, a técnica de plate wash PCR, onde todas as colônias de uma placa réplica são ressuspendidas e tem seu DNA extraído e submetido a PCR com iniciador específico para observar a presença de Acidobacteria. A presença de fungos impediu o isolamento subsequente das acidobactérias das amostras utilizadas com esta técnica. Outra técnica de detecção testada foi a de colony PCR, na qual cada colônia coletada é utilizada diretamente como template para PCR. Essa técnica permitiu a detecção de 19 acidobactérias de um total de 159 colônias submetidas à PCR com iniciador específico. Apenas cinco isolados permaneceram em cultura e a análise das sequências do gene RNAr 16S sugere que sejam novas espécies de Acidobacteria. Os isolados AB20, AB23 e AB 60 apresentam colônias semelhantes entre si sendo diferentes dos isolados AB39 e AB158, embora a análise filogenética das sequências mostre o isolado AB158 dentro do grupo de AB20, AB23 e AB60. Todos os isolados são capazes de utilizar glicose, extrato de levedura e xilana. Quitina, CMC e avicel também foram testadas, mas o resultado não foi conclusivo. O crescimento a 37oC foi analisado nos isolados AB20, AB23 e AB60 e somente o isolado AB23 apresentou crescimento. O isolado AB60 foi testado quanto à variação de pH e ocorreu crescimento em pH 4.5 e 5.5, não sendo observado em 6.5 e o tempo de crescimento em meio líquido foi menor do que o observado em placa. A microscopia mostrou que todos os isolados são Gram-negativos, tendo alguns dos isolados formatos de bacilo ou cocobacilo. Foi realizada também análise do perfil proteico dos isolados por meio de espectrometria de massa MALDI TOF e visualmente, é possível afirmar que os isolados são diferentes entre si. Os resultados obtidos neste trabalho não foram capazes de diferenciar os isolados, exceto pela espectrometria de massa. Embora a análise filogenética utilizando-se a sequencia do RNAr 16S mostre que essas bactérias sejam novas espécies, mais testes bioquímicos são necessários para a confirmação. (CASTRO, V.H.L. de, 2011)

Abstract - Although there are few studies on the soil microbial community from the Cerrado biome a recent metagenomic analysis revealed the dominance of the phylum of Acidobacteria in four different types of vegetation. Although the 16A rRNA gene sequences from these bacteria have been found in samples all over the world, there are only 14 species fully described. Therefore little is known about their physiology and their role in the biogeochemical cycles. In the present work, a culture medium used to isolate several Acidobacteria from an Australian soil was tested to cultivate Acidobacteria from the Cerrado. Soil was collected from the IBGE-RECOR area for preliminary experiments. This soil was plated on VL55 medium with xylan as sole carbon source and the medium R2A. When compared, colonies from bacteria grew slower in VL55 medium and presented higher number of colony morphologies. Moreover, these experiments revealed that 10-6 was the appropriate dilution for this soil as well as the need of cycloheximide to inhibit fungal growth. Soil collected in the Fazenda Capão Comprido was used to isolate Acidobacteria using VL55 medium. In order to detect Acidobacteria, Plate wash - PCR technique was initially used. This technique requires the extraction of the DNA from all colonies on a Petri dish without their isolation. Acidobacteria was detected by PCR using specific primer for this phylum; however, the presence of fungus prevented subsequent isolation of Acidobacteria. Colony - PCR was then used and allowed the detection of 19 Acidobacteria out of 159 colonies tested. Only 5 bacterial isolates were successfully maintained in culture. Sequencing analysis of the 16S rRNA gene suggested that these bacteria are new species of the phylum Acidobacteria. Isolates AB20, AB23, and AB60 presented colonies with similar morphology but distinct from isolates AB39 and AB158. However, phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequence indicated that isolate AB158 belongs to the same group as AB20, AB23 and AB60. All isolates were capable to use glucose, yeast extract and xylan as carbon sources. Chitin, CMC and avicel were tested but the results were inconclusive. Growth at 37C was analyzed for isolates AB20, AB23 and AB60, but among then only the isolate AB23 exhibited growth at this temperature. The optimum pH for growth was tested for isolate AB60 and growth was observed on pHs 4.5 and 5.5. Microscopy analysis showed that all isolates were Gram-negative bacilli or Gram negative cocobacilli. The analysis of the protein profile by mass spectrometry MALDI-TOF indicated that all isolates were different from each other. Results obtained in this work were not sufficient to differentiate the isolates except for the mass spectrometry. Although the phylogenetic analysis using the sequence of the 16S rRNA gene suggested that these bacteria are new species, more biochemical and molecular tests are necessary to confirm this hypothesis.